'n Fluoressensiefilter is 'n noodsaaklike komponent in fluoressensiemikroskoop.'n Tipiese stelsel het drie basiese filters: 'n opwekkingsfilter, 'n emissiefilter en 'n dichroïese spieël.Hulle word gewoonlik in 'n kubus verpak sodat die groep saam in die mikroskoop geplaas word.
Hoe werk 'n fluoressensiefilter?
Opwekkingsfilter
Opwekkingsfilters stuur lig van 'n spesifieke golflengte uit en blokkeer ander golflengtes.Hulle kan gebruik word om verskillende kleure te produseer deur die filter te verstel om slegs een kleur deur te laat.Die opwekkingsfilters kom in twee hooftipes voor - langdeurlaatfilters en banddeurlaatfilters.Die opwekker is gewoonlik 'n banddeurlaatfilter wat slegs die golflengtes deurlaat wat deur die fluorofoor geabsorbeer word, en sodoende die opwekking van ander bronne van fluoressensie tot die minimum beperk en opwekkingslig in die fluoressensie-emissieband blokkeer.Soos getoon deur die blou lyn in die figuur, is BP 460-495, wat beteken dat dit slegs deur die fluoressensie van 460-495nm kan gaan.
Dit word binne die beligtingspad van 'n fluoressensiemikroskoop geplaas en filtreer alle golflengtes van die ligbron uit, behalwe vir die fluorofoor-opwekkingsreeks.Die filter minimum transmissie dikteer die helderheid en glans van beelde.'n Minimum van 40% transmissie vir enige opwekkingsfilter word aanbeveel sodat die transmissie ideaal is >85%.Die bandwydte van die opwekkingsfilter moet heeltemal binne die fluorofoor-opwekkingsreeks wees sodat die middelgolflengte (CWL) van die filter so na as moontlik aan die piekopwekkingsgolflengte van die fluorofoor is.Die opwekking filter optiese digtheid (OD) dikteer die agtergrond beeld donkerte;OD is 'n maatstaf van hoe goed 'n filter die golflengtes buite transmissiereeks of bandwydte blokkeer.'n Minimum OD van 3.0 word aanbeveel, maar 'n OD van 6.0 of meer is ideaal.
Emissie filter
Emissiefilters dien die doel om die gewenste fluoressensie van die monster toe te laat om die detektor te bereik.Hulle blokkeer korter golflengtes en het hoë transmissie vir langer golflengtes.Die filtertipe word ook geassosieer met 'n nommer, bv. BA510IF in die figuur (interferensieversperringsfilter), daardie benaming verwys na die golflengte by 50% van sy maksimum transmissie.
Dieselfde aanbevelings vir opwekkingsfilters geld vir emissiefilters: minimum transmissie, bandwydte, OD en CWL.’n Emissiefilter met die ideale CWL, minimum transmissie en OD-kombinasie verskaf die helderste moontlike beelde, met die diepste moontlike blokkering, en verseker die opsporing van die swakste emissieseine.
Dichroïese spieël
Die dichroïese spieël word teen 'n hoek van 45° tussen die opwekkingsfilter en emissiefilter geplaas en reflekteer die opwekkingsein na die fluorofoor terwyl die emissiesein na die detektor gestuur word.Ideale dichroïese filters en straalverdelers het skerp oorgange tussen maksimum refleksie en maksimum transmissie, met 'n >95% refleksie vir die bandwydte van die opwekkingsfilter en 'n transmissie van >90% vir die bandwydte van die emissiefilter.Kies die filter met die kruisingsgolflengte (λ) van die fluorofoor in gedagte, om dwaallig te minimaliseer en die fluoresserende beeld sein-tot-geraas verhouding te maksimeer.
Die dichroïese spieël in hierdie figuur is die DM505, so genoem omdat 505 nanometer die golflengte is by 50% van die maksimum transmissie vir hierdie spieël.Die transmissiekromme vir hierdie spieël toon hoë transmissie bo 505 nm, 'n skerp daling in transmissie aan die linkerkant van 505 nanometer, en maksimum reflektiwiteit aan die linkerkant van 505 nanometer, maar kan steeds 'n mate van transmissie onder 505 nm hê.
Wat is die verskil tussen langdeurlaat- en banddeurlaatfilters?
Fluoresentasie filters kan in twee tipes verdeel word: lang deurlaat (LP) en band deurlaat (BP).
Langdeurlaatfilters stuur lang golflengtes uit en blokkeer die korters.Die afsnygolflengte is die waarde by 50% van piektransmissie, en alle golflengtes bokant die insnyding word deur die langdeurlaatfilters oorgedra.Hulle word gereeld in dichroïese spieëls en emissiefilters gebruik.Langdeurlaatfilters moet gebruik word wanneer die toepassing maksimum emissieversameling vereis en wanneer spektrale diskriminasie nie wenslik of nodig is nie, wat oor die algemeen die geval is vir probes wat 'n enkele emitterende spesie genereer in monsters met relatief lae vlakke van agtergrond outofluoressensie.
Banddeurlaatfilters stuur slegs 'n sekere golflengteband uit en blokkeer ander.Hulle verminder oorspraak deur toe te laat dat slegs die sterkste gedeelte van die fluorofoor emissiespektrum oorgedra word, verminder outofluoressensie geraas en verbeter dus die sein-tot-geraas verhouding in hoë agtergrond outofluoressensie monsters, wat lang deurlaat filters nie kan bied nie.
Hoeveel tipes fluoressensiefilterstelle kan BestScope verskaf?
Sommige algemene tipes filters sluit blou, groen en ultraviolet filters in.Soos in die tabel getoon.
| Filterstel | Opwekkingsfilter | Dichroïese spieël | Versperringsfilter | LED-lamp Golflengte | Toepassing |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Fluorescerende teenliggaampie metode · Suurlemoen: DNA, RNA ·Auramine: Tuberkel-basil ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Fluorescerende teenliggaampiemetode ·Propidiumjodied: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | ·Outo-fluoressensie waarneming ·DAPI: DNA-kleuring ·Hoechest 332528, 33342: gebruik vir chromosoomkleuring |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · Katekolamiene ·5-hidroksi triptamien ·Tetrasiklien: Skelet, Tande |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Filterstelle wat in fluoressensie-verkrygings gebruik word, is ontwerp rondom die belangrikste golflengtes wat in fluoressensietoepassings gebruik word, wat gebaseer is op die mees gebruikte fluorofore.Om hierdie rede is hulle ook vernoem na die fluorofoor wat hulle bedoel is vir beeldvorming, soos DAPI (blou), FITC (groen) of TRITC (rooi) filterblokkies.
| Filterstel | Opwekkingsfilter | Dichroïese spieël | Versperringsfilter | LED-lamp Golflengte |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas Rooi | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Hoe kies jy 'n fluoressensiefilter?
1. Die beginsel van die keuse van fluoressensiefilter is om die fluoressensie/emissielig so ver as moontlik deur die beeldend te laat gaan, en terselfdertyd die opwekkingslig heeltemal te blokkeer, om sodoende die hoogste sein-tot-geraas verhouding te verkry.Veral vir die toepassing van multifoton-opwekking en totale interne refleksie-mikroskoop, sal die swak geraas ook groot inmenging tot die beeldeffek veroorsaak, dus is die vereiste vir sein tot geraasverhouding hoër.
2. Ken die opwekking en emissiespektrum van die fluorofoor.Om 'n fluoressensie filterstel te konstrueer wat 'n hoë-gehalte, hoë-kontras beeld met 'n swart agtergrond genereer, moet opwekking en emissie filters hoë transmissie bereik met minimale deurlaatband rimpeling oor die streke wat ooreenstem met die fluorofoor opwekking pieke of emissies.
3. Oorweeg die duursaamheid van fluoressensiefilters.Hierdie filters moet ondeurdringbaar wees vir intense ligbronne wat ultraviolet (UV) lig genereer wat kan lei tot “uitbranding”, veral van die opwekkerfilter aangesien dit aan die volle intensiteit van die beligtingsbron onderwerp word.
Die verskillende fluoresserende voorbeeldbeelde
Die hulpbronne word op die internet versamel en georganiseer, en word slegs vir leer en kommunikasie gebruik.As daar enige oortreding is, kontak ons asseblief om dit uit te vee.
Postyd: Des-09-2022